Изучение возможности коррекции экспериментальной инсулиновой недостаточности путем трансплантации клеточных культур селезеночной ткани

Фаязов Р.Р., Тимербулатов Ш.В., Ишмухаметов И.С., Чанышев Б.Ф.

Кафедра хирургии с курсом эндоскопии ИПО ГБОУ ВПО БГМУ Минздравсоцразвития России, Уфа, 01.01.2012

Актуальность.

В хирургической практике аутотрансплантацию селезеночной ткани (АСТ) можно рассматривать как вариант восстановительной терапии стромальными стволовыми клетками селезенки [1, 10, 11, 12, 13, 19, 20]. Для регуляции восстановительных процессов в поврежденных органах и тканях различного фенотипа возможно использование селезеночной ткани, которой присуща не только иммуногенетическая, но и морфогенетическая функция [1, 5, 10, 11, 12, 13]. Проведенное нами экспериментальное исследование на лабораторных животных с достижением панкреатэктомической и аллоксановой инсулиновой недостаточности (ИН) показало, что АСТ в ряде случаев позволяет достичь стойкой стабилизации показателей сахара крови [11, 12, 13 ]. В ходе последующих этапов исследования нами был рассмотрен вопрос относительно возможности и эффективности использования клеток селезеночной ткани в целях коррекции ИН.

Материал и методы.

Исследование в эксперименте на животных выполнено на 200 белых половозрелых крысах линии Wistar с достижением панкреатэктомической и аллоксановой ИН. Уровень сахара крови определяли 2 раза в сутки глюкометром «One toch ultra» (США), в моче - в лабораторных условиях. Пол животных не учитывался. Для достижения хронического опыта коррекция ИН проводилась однократным введением в сутки препарата «Хумулин», подкожно, в расчете 0,5 ЕД /кг массы тела животного (предварительно разбавленного на 100 мл физиологического раствора). В ходе эксперимента, по мере необходимости производилась подсадка самок к самцам с целью оплодотворения. На 12-14 сутки беременности под эфирным наркозом крысам производилась лапаротомия, извлечение плодов из матки, далее плодам выполнялась лапаротомия и производился забор селезенки. С соблюдением правил асептики селезенка эмбриона направлялась в лабораторию для культивирования.

Панкреатэктомическую ИН у 50 крыс (1 группа) вызывали путем тотального удаления поджелудочной железы и селезенки, под эфирным наркозом. При этом, в целях изучения возможности профилактики ИН, выполняли аутотрансплантацию Ѕ части селезенки в виде фрагментов размерами 0,3 х 0,3 х 0,3 см, с имплантацией их в большой сальник. Оставшаяся часть селезеночной ткани обрабатывалась в среде 199 с добавлением антибиотиков и с соблюдением правил асептики направлялась в лабораторию для выделения и последующего культивирования жизнеспособных клеток селезенки по общепринятой методике [3, 8, 16]. С целью извлечения аутотрансплантатов для исследования их клеточной структуры на 7-ые сутки 5 крыс подверглись острому опыту.

Культивирование клеток селезеночной ткани производилось в проблемной научно-исследовательской лаборатории трансплантологии ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» по следующей схеме: после механического диспергирования селезеночную ткань помещали в колбу с раствором трипсина с последующей трипсинизацией в магнитной мешалке при нагревании до 37,0C, в течение 3-х минут. Затем проводили отмывание селезеночных клеток с помощью центрифугирования (10 минут при 1500 оборотов/мин.). Отмытые клетки селезенки культивировали в течение 7 суток в среде ДММ с добавлением 5% раствора эмбриональной сыворотки («Биолот» (Санкт-Петербург)) в термальной комнате. Ежедневный мониторинг за культурой клеток осуществлялся при помощи инвертированного микроскопа с программным обеспечением фирмы DMIL «Leica» (Германия).

Экспериментальную аллоксановую ИН у 150 крыс (2 группа) вызывали путем однократного подкожного введения 5% водного раствора аллоксана из расчета 125 мг/ кг массы тела животного на фоне 24-48 часового голодания [ 2, 11 ]. Данной группе животных на 7-ые сутки после начала эксперимента вводили аллогенный клеточный материал в двух вариантах.

Группу 2А составили 60 крыс, которым вводился аллогенный клеточный материал, культивированный из селезеночной ткани 14-суточного эмбриона.

Группу 2В составили 90 крыс, которым вводился аллогенный клеточный материал, культивированный из части удаленной селезеночной ткани. Клеточный материал в количестве 1 мл., что соответствует 1 млн. клеток, вводился с помощью инъекции в хвостовую часть лабораторного животного. Проведенное исследование в данной группе предполагало получить ответ на возможность коррекции  экспериментальной ИН путем использования клеточных культур селезеночной ткани. Необходимо отметить, что во 2 группе заместительная коррекция ИН проводилась до введения клеточной культуры, а в 1 группе - в послеоперационном периоде (в первые 2-3 недели), после чего отменялась.

Для выяснения возможности выживания и фенотипических особенностей аутогенных спленоцитов, реимплантированных в брюшную полость у 5 крыс 1-ой группы, на 7-ые сутки проводили релапаротомию, извлекали фрагменты, измельчали их в стеклянном гомогенизациторе в растворе CellWash(BD) и осуществляли окрашивание и цитометрию. Для выяснения фенотипических особенностей спленоцитов после их культивирования осуществляли стандартное иммунофлюоресцентное окрашивание клеток с использованием меченых флюорохромами моноклональных антител против антигенов CD45 и CD90 крыс (использованы антитела фирмы Caltag Labs, США). Затем проводили проточную цитофлюорометрию на цитометре FACSCalibur (исследования выполнены на базе лаборатории иммунофармакологии УрО РАН).

Результаты и их обсуждение.

У экспериментальных крыс 1 группы через несколько часов после полного удаления поджелудочной железы наступала гипергликемия и глюкозурия, максимальные величины которых отмечались с 3-4-го дня после операции. Содержание сахара в крови колебалось от 33 до 40 ммоль/л. К концу третьей недели коррекция сахара у 28 крыс препаратом «Хумулин» была отменена, и по показателям уровня сахара крови - отпала необходимость. Остальные 22 крысы погибли в разные сроки после операции, в т.ч. 5 крыс после острого опыта. Данное исследование позволяет сделать вывод, что тотальная панкреатэктомия у крыс вызывает выраженное гипергликемическое состояние, что приводит к гибели в первые сутки и недели после операции в результате развития кетоацидоза. Введение соответствующей дозы инсулина позволяет острый эксперимент перевести в хронический, т.е. более половины экспериментальных животных можно использовать для изучения течения заболевания. В нашем опыте, на ранних этапах послеоперационного периода ИН корригировалась введением пролонгированного инсулина, после его отмены гипергликемия не приобретала крайнего характера, что позволяет сделать вывод о наличии компенсаторного механизма, и  данным механизмом могут выступать имплантированные ткани собственной селезенки.

Во 2  группе аллоксановая ИН получена у всех животных. Первые 3 дня являются критическими и 23 крысы погибли в эти сроки. Причина смерти - гипергликемическая кома. Коррекцию ИН проводили введением пролонгированного инсулина, что позволило перевести остальных лабораторных животных в хронический эксперимент. В первую неделю показатели сахара крови колебались от 35,5 до 43,5 ммоль/л., заместительная коррекция продолжалась в течение одной недели. К концу  недели всем животным проводилась инъекция аллогенных клеточных культур в 2 вариантах - эмбриональной и «взрослой» селезенки. Крысам продолжалась заместительная коррекция ИН еще в течение недели, после чего она была отменена. Если в первую неделю после клеточной терапии показатели сахара крови колебались от 14,5 до 22,0 ммоль/л, то в последующем отмечалось снижение в среднем до 8,5 единиц. Если во 2А группе крыс отмечалось более ускоренное,  значительное и стойкое снижение, то во 2В группе снижение показателей носил длительный и волнообразный характер. Лабораторные животные стали более активными и начали хорошо питаться. Данное исследование позволяет убедиться, что аллогенная имплантация селезеночной ткани с течением времени (более 3 недель) в большинстве случаев приводит к коррекции ИН до нормальных показателей.

Известно, что стволовые клетки гематопоэтического происхождения экспрессируют на мембране как общелейкоцитарный антиген - гликопротеин CD45, так и, в отличие от зрелых клеток, антиген белок CD90 (Thy-1). На представленном рисунке (Рис.1) видно, что в культурах спленоцитов взрослых крыс количественно преобладали зрелые, CD45+CD90- клетки (78 %), доля стволовых гематопоэтических клеток (CD45+CD90+) составила 11 %. В культурах эмбриональных спленоцитов зрелых гематопоэтических клеток было 20 %, стволовых - 21 %. Причем, несмотря на небольшое число наблюдений, в рамках однофакторного дисперсионного анализа были выявлены статистически значимые различия (F - критерий Фишера - 23.4, P = 0.0084). Интересно, что в культурах эмбриональных спленоцитов идентифицировались клетки, которые экспрессировали антиген CD90, но не экспрессировали лейкоцитарный антиген CD45. Такой фенотип характерен для мезенхимальных стволовых клеток [17 ]. Клеточная структура извлеченных из брюшной полости аутологичных фрагментов селезенки также характеризовалась как наличием зрелых форм гемопоэтических клеток, так и стволовых гемопоэтических и стромальных клеток. Этот факт представляется весьма существенным, учитывая способность к самой разнообразной дифференцировке этих клеток.

Рис. 1  Распределение культур спленоцитов взрослых крыс.

При динамическом микроскопическом наблюдении за культурой клеток селезеночной ткани крыс выявлено образование монослоя на 4-ые сутки. Среди монослоя образуются шаровидные скопления клеток с выраженной пролиферацией. В центре «шара» единичные крупные клетки с крупными ядрами и выраженной цитоплазмой (мезенхимальные стволовые клетки). Начиная с 10–х суток из «шаров» отделяются скопления клеток, которые также приобретают шаровидную форму, в них также идет интенсивная пролиферация. Такое сосуществование «клона» с микроокружением, выраженная пролиферация клеточной культуры еще раз подтверждает, что в ткани селезенки сосредоточены запасы стволовых клеток ( Рис. 2). 

Рис.2 Образование шаровидных скоплений клеток с выраженной пролиферацией. В центре «шара» единичные крупные клетки с крупными ядрами и выраженной цитоплазмой (мезенхимальные стволовые клетки).

По предварительным результатам нашего исследования мы можем предположить, что замещение постспленэктомического иммунодефицита и постпанкреатэктомической ИН происходит за счет участия в регенерации стволовых клеток селезеночной ткани под воздействием биохимических сигнальных веществ, т.е. белковых молекул, способствующих хоумину - способности клеток к миграции в "нужное место" - "родной" орган и ткань (в свою стволовую нишу) или в область повреждения. Данное исследование подтверждает возможность имплантации фетальных и стромальных стволовых клеток вне зависимости от зоны пораженного органа. Безусловно, миграционная способность клеток обусловлена биохимическими сигналами, исходящими из "нужной" области, системой рецепции клетки и способностью к хемотаксису [ 3, 8, 16, 21, 24 ]. Поскольку стволовые клетки изначально обладают «свободной специализацией», т.е. они являются исходными при образовании специализированных дифференциальных клеток, но до тех пор, пока они не получат генетический сигнал, их деятельность в организме ограничивается только многократным дуплицированием (удвоением) какого-либо участка хромосомы [ 7, 14 ]. Отсутствие инсулина в обменных процессах в нашем исследовании является исходным для посылки генетического сигнала для всех остальных тканей, в т.ч. для имплантируемой селезеночной ткани. Под воздействием генетического сигнала происходит нужная дифференциация стволовых клеток селезеночной ткани в  b-клетки, которые вырабатывают инсулин. Способность стволовых клеток длительное время воспроизводить себе подобных также является уникальной: в отличие от нормальных, «стволовые» клетки могут быть практически неограниченным источником первичного клеточного «сырья» [ 6, 14 ].  При их делении часть из дочерних клеток остается стволовыми, а другая начинает процесс дифференцировки. Особой разницы в степени универсализма между обычными и эмбриональными клетками нет. Экспериментальное доказательство этого факта впервые представили широкой общественности американские ученые из Института Стволовых клеток университета Миннесоты (США).

Следовательно, с большой вероятностью можно утверждать о существовании причинно-следственной связи между АСТ и возможностью дифференцировки стволовых клеток имплантата в необходимые организму клеточные структуры, т.е., в нашем исследовании, в инсулинопродуцирующие клетки в условиях in vivo. Существует же эффективная методика имплантации костного мозга в лечении сахарного диабета [ 18 ], а селезенка также являясь одним из органов кроветворения, скорее всего богата стволовыми клетками. Не исключается, что в селезенке находится неизвестный ранее источник стволовых клеток, играющий важную роль в лечении некоторых типов повреждений и травм.

Особого внимания заслуживает недавнее сообщение группы ученых из Massachusetts General Hospital (Бостон, США), обнаруживших, что селезенка может быть источником взрослых стволовых клеток, которые способны восстанавливать инсулин-продуцирующие участки поджелудочной железы [19 ]. Вслед за этим неожиданным открытием, теперь исследователи сообщают, что эти взрослые стволовые клетки продуцируют протеин Hox11, который, как предполагалось ранее, присутствует у млекопитающих лишь в период эмбрионального развития и играет огромную роль при дифференцировке клеток [ 20 ]. Исследователи также обнаружили, что селезенка развивается из эмбриональной ткани, которая формирует из стволовых клеток не только различные типы клеток крови, но, возможно, и такие разные органы, как тонкая кишка, поджелудочная железа, сосуды и легкие. Ученые полагают, что источник этих стволовых клеток может оставаться и в селезенке взрослого человека. Оба сообщения подтверждают наличие в селезенке стволовых клеток, которые, по предположениям ученых, способны развиваться в большее число разновидностей тканей, чем другие взрослые клетки.

Основанием полагать, что селезенка является источником стволовых клеток, нам позволяют результаты собственных экспериментальных исследований, выполненных по обоснованию возможности использования эмбриональной селезеночной ткани в коррекции постспленэктомического синдрома [ 10, 12 ]. После аллогенной трансплантации зародышевой селезеночной ткани под кожу уха взрослым кроликам, гистологические исследования показали, что на различном расстоянии от белой и красной пульпы формирующейся селезенки располагаются довольно большого размера скопления лимфоидной ткани, состоящие из лимфоцитов, макрофагов и плазматических клеток. Такого рода скопления лимфоидных клеток возникают в результате деления стволовых клеток имплантата, так как соединительная ткань дермы не проявляет признаков воспалительной реакции. Определяется функциональная активность макрофагов красной пульпы, выполняющих фильтрационную функцию, поглощая поврежденные эритроциты. Данный факт может служить подтверждением того, что трансплантированная селезеночная ткань может выполнять обезвреживающую функцию. Однако нельзя исключить возможность миграции макрофагов из прилегающих тканей донора и поступление  продуктов распада гемоглобина из сети сосудов, расположенных вокруг трансплантата. В нашем исследовании возник вопрос в отношении возможности дифференцировки клеток селезенки в b-клетки поджелудочной железы в условиях отсутствия последней, т.е. после тотальной панкреатэктомии. В настоящее время в научной литературе бурно обсуждается возможный механизм действия стромальных клеток - их прямая трансдифференцировка в b-клетки. Итак, возможно ли это? Первая "глобальная" работа была опубликована группой Andrea Ianus, где была показана возможная дифференцировка клеток костного мозга мыши в b-клетки in vivo (при их введении) без признаков слияния клеток. Клетки костного мозга модифицировали генетически так, что при начале синтеза инсулина они начинали продуцировать и зелёный флюоресцентный белок (т.е. "светиться зелёным" при флюоресцентной микроскопии). Через 4-6 нед. после трансплантации около 2-3% клеток донорского костного мозга"светились", при 70-90% эффективности интеграции (engraftment). Эти клетки были отсортированы и экспрессировали типичные для b-клеток маркёры, синтезировали инсулин и отвечали на стимуляцию глюкозой [ 18 ]. В комментарии к этой статье  приведены возможные причины и объяснения такого "поведения" клеток костного мозга. В частности, указываются некие онтогенетические пути, объединяющие эти ткани, и экспрессия общих поверхностных рецепторов (например Kit (CD117)) [ 21 ]. Появились работы, указывающие на возможность синтеза инсулина стромальными клетками в in vitro условиях. Австралийская группа "заставила" человеческие стволовые клетки костного мозга вырабатывать инсулин путём трансфекции ретровирусной ген-конструкцией, содержащей проинсулиновую к-ДНК человека. Причём как гемопоэтические клетки (2 линии, полученные из ACCC), так и первичные мезенхимальные [ 26 ]. Работа отечественных учёных, опубликованная в журнале «Онтогенез», показывает возможность получения инсулин-продуцирующих клеток из стромальных стволовых клеток костного мозга in vitro [ 24 ]. Из приведенных выше источников мы можем объяснить факт дифференцировки стволовых клеток трансплантированной селезеночной ткани в инсулинопродуцирующие клетки (учитывая то обстоятельство, что взрослые стволовые клетки костного мозга и селезенки возможно имеют общее начало) под влиянием определенных сигналов (пусковым механизмом в нашем исследовании является отсутствие инсулина в крови + гипергликемия + мобилизация стволовых клеток селезеночной ткани) и, как объясняют некоторые исследователи, наличием общих путей развития в эмбриональном периоде селезенки, печени и поджелудочной железы [19 ].

Выводы.

1. Экспериментальная аллоксановая и панкреатэктомическая инсулиновая недостаточность  в настоящее время является наиболее удобной моделью сахарного диабета человека и продолжает сохранять значение в научных исследованиях.
2. Использование способа аутотрансплантации селезеночной ткани при выполнении панкреатэктомии позволяет провести профилактику инсулиновой недостаточности более чем у половины экспериментальных животных, что дает основание предположить о возможности получения подобного эффекта при применении в клинической практике.
3. Использование трансплантации аллогенных клеточных культур фетальной и «взрослой» селезеночной ткани при аллоксановой инсулиновой недостаточности позволяет достичь ее коррекции  у большинства экспериментальных животных.
4. Цитофлюрометрическое исследование трансплантируемых аллогенных спленоцитов после длительного культивирования, также аутологичных фрагментов селезенки, реимплантированных в брюшную полость показало, что в их составе идентифицируются гемопоэтические и стромальные стволовые клетки, которые, возможно, способны участвовать в восстановлении инсулин-продуцирующих клеток в организме экспериментального лабораторного животного.

Литература.

1. Апарцин К.А. Хирургическая профилактика и способы коррекции послеоперационного гипоспленизма: // Дисс. … док-ра мед. наук.- Иркутск, 2001.-293с.
2. Баранов В.Г., Соколоверова И.М., Гаспарян Э.Г. и др. Экспериментальный сахарный диабет. Роль в клинической диабетологии. – Л.: Наука. – 1983. – 240с.
3. Берсенев А.В. Клеточная трансплантология – история, современное состояние и перспективы //  Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. – 2005. - №1. – С.49-56.
4. Бордуновский В.Н. Пластическая хирургия селезенки и печени (экспериментально-клиническое исследование): Автореф. дисс… д-ра мед. наук. -  Пермь, 1992. – 50 с.
5. Онищенко Н.А., Базиева Ф.Х., Мамхегова Т.Р., Первакова Э.И.    // К механизму восстановления функций пораженной печени с помощью устройств биоискусственной поддержки печени //Трансплантология и искусственные органы. – 1997.- №4.- С. 86-91.
6. Оганесян Т. Клетки свободной специализации // Эксперт – наука и технология. - 2002.- №26. –С. 45-48.
7. Репин В.С., Ржанинова А.А., Шаменков Д.А. Эмбриональные стволовые клетки: фундаментальная биология и медицина. – М.: «Реметэкс», 2002.- 175с.
8. Сергеев В.С. Иммунологические свойства мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток //  Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. – 2005. - №2. – С.39-42.
9. Скалецкий Н.Н., Кирсанова Л.А., Блюмкин В.Н. В кн.: «Проблемы трансплантологии и искусственных органов». М., 1994. – С. 73-80.
10. Тимербулатов М. В., Хасанов А.Г., Фаязов Р.Р., Каюмов Ф.А. Органосохраняющая и миниинвазивная хирургия селезенки. – М.: «МЕДпресс - информ», 2004. – 218с.
11. Тимербулатов В.М., Фаязов Р.Р., Тимербулатов Ш.В., Саяпов М.М., Саубанов М.Н. Перспективы использования трансплантации селезеночной ткани при экспериментальной инсулиновой недостаточности /Вестник Уральской медицинской академической науки. – Екатеринбург,  2006.- №1. – С. 113-116.
12. Тимербулатов В.М., Фаязов Р.Р., Хасанов А.Г., Тимербулатов М.В., Уразбахтин И.М. Хирургия абдоминальных повреждений. – М.: «МЕДпресс-информ», 2005.-255с.
13. Тимербулатов В.М., Фаязов Р.Р., Хасанов А.Г., Рахматуллин С.И., Тимербулатов Ш.В., Саяпов М.М.  Возможна ли коррекция инсулиновой недостаточности путем аутотрансплантации селезеночной ткани? / Хирургия.- 2006.-№3.-С. 22-28.
14. Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А. Клеточные основы кроветворного микроокружения.-М.: Медицина,-1980.-216с.
15. Шевченко Ю.Л. Медико-биологические и физиологические основы клеточных технологий в сердечно-сосудистой хирургии. – СПб.: «Наука», 2006. – 287с.
16. Шумаков В.И., Скалецкий Н.Н.  Трансплантация островковых и других эндокринных клеток // В кн.: «Трансплантология - руководство». – Тула: «Репроникс Лтд. », 1995. – с 317-331.
17. Bieback K., Susanne Kern S., Klьter H. et al. Critical Parameters for the Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Umbilical Cord Blood // Stem Cells.- 2004.- V. 22.- P.625-634
18. Ianus A, et al. In vivo derivation of glucose-competent pancreatic endocrine cells from bone marrow without evidence of cell fusion //J. Clin. Invest. 2003.- V.111.- P.843–850;
19. Kodama S., Faustman D.L. Routes to regenerating islet cells: stem cells and other biological therapies for type 1 diabetes // Pediatr. Diabetes.- 2004. - V.5.- Suppl. 2. – P.38-44.
20. Kodama S., Davis M., Faustman D.L. Diabetes and Stem Cell Researchers Turn to the Lowly Spleen // Sci. Aging. Knowl. Environ.-2005.- V.3.-P.2-3.
21. Lee V.M., Stoffel M. Bone marrow: An extra-pancreatic hideout for the elusive pancreatic stem cell? // J. Clin. Invest.- 2003.-V.6.- P.799–801.
22. Musaro A. et al. Stem cell-mediated muscle regeneration is enhanced by local isoform of insulin-like growth factor 1. //PNAS.–2004. - V. 5.- P.1206-1210.
23. Ryan E.A., Lakey J., Paty B.W. et all.  //Diabetes. – 2002. – V.51. – P. 2148-2157.
24. Shchegel'skaia E.A. et al. Pluripotency of bone marrow stromal cells and perspectives of their use in cell therapy //Ontogenez.- 2003.- V. 34.-P.228-235.
25. Torella E. et al. Cardiac stem cell and myocyte aging, heart failure, and insulin-like growth factor-1 overexpression //Circ. Res.- 2004.-V. 94.-P. 514-524.
26. Wong R.Y.L. et al. Synthesis and release of human (pro)insulin in human BM progenitor cells // Cytotherapy.- 2003.- V.3. P. 273-275.